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胡璐璐/刘杰/何川等团队合作开发：利用飞行时间核酸质谱定量检测超微量样本中核酸表观修饰的新方法LAMP-MS
太阳诚1382网址 发布时间：2024-11-22 太阳诚1382网址 来源：微信公众号 太阳诚1382网址 浏览量：2328



2024年11月4日，国际化学类顶级期刊《德国应用化学国际版》（Angewandte Chemie-international Edition）（IF 16.1）上发表了题为《LAMP-MS for Locus-Specific Visual Quantification of DNA 5mC and RNA m6A Using Ultra-Low Input》的研究论文。报道了一种基于核酸质谱平台的创新甲基化检测方法，该工作由复旦大学医学院胡璐璐研究员团队、华山医院消化科刘杰主任团队、美国芝加哥大学何川院士团队携手柏锘（上海）医疗科技有限公司共同完成。

该研究中所使用的飞行时间质谱平台为太阳诚1382网址生命科学板块旗下聚致生物（GenWish）自主研发的GeneTOF 3100核酸质谱分析系统。


液体活检技术通过收集血液中来自各种组织的游离DNA（cfDNA），对其中包含的生物标志物（如基因突变、甲基化或羟甲基等表观修饰）进行检测，具有无创、高效的特点。与传统的各种检测技术（例如胃肠镜、血清标志物）相比，液体活检在临床上具有革命性的优势，在癌症等疾病的早筛早诊、预后监测、疗效评估等诸多方面有广阔的应用前景。

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，可在肿瘤发生的早期被检测到，且具有较好的稳定性，因此成为肿瘤液体活检中一个极具价值的生物标志物。但是，目前基于亚硫酸氢盐测序技术的甲基化检测方法，很难避免DNA的降解；且高通量测序成本较高，实验后的分析工作复杂；PCR检测涵盖的位点也有限，因此开发一种经济、可靠、通量灵活且能够覆盖多位点的新甲基化检测方法，是非常具有意义的。

研究团队开发的LAMP-MS方法创造性地将线性扩增和飞行时间质谱技术结合在一起，只需要1ng血浆cfDNA，通过多重PCR和单碱基引物延伸，能够在较短时间内同时检测数十个甲基化位点。该技术主要操作步骤如图1所示：


LAMP-MS的完整工作流程

  • 从血浆中提取1ng的cfDNA样本，经过末端修复后，用含有甲基化双链T7启动子的DNA接头进行连接；

  • 进行亚硫酸氢盐处理后，非甲基化的胞嘧啶（dC）转化为尿嘧啶（dU），而甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不变；

  • 使用T7 RNA聚合酶进行无偏好性线性扩增，产生μg数量级的RNA产物；

  • 逆转录产生微克水平的cDNA；

  • 通过序列特异性PCR对含有特定DNA甲基化位点的DNA片段进行指数扩增；

  • 对特定的DNA片段进行文库构建和浅测序（1~2G深度），称为靶向LAMP-Seq，以确定5mC的化学计量；

  • 利用位点特异性引物进行单碱基延伸，如果延伸位点配对的是ddATP，代表此处为未甲基化的C，如果是ddGTP则代表甲基化的5mC，通过相应的质谱峰计算 5mC/C 比值。

为验证LAMP-MS方法的性能，研究团队合成了含有0%、5%、10%、25%、50%、75%及100% 5mC的一系列DNA探针混合物，利用1ng的上述探针混合物对LAMP-MS方法进行测试。结果表明，LAMP-MS能够准确地定量测量从0%到100%的5mC（图2A），图2B中标曲表明检测准确性和理论值高度吻合。此外，文章表示，LAMP-MS在1ng探针混合物体系下的检测限为5%的5mC的甲基化率（图2B）。

图2A 使用1ng 5mC探针验证LAMP-MS方法的灵敏度和准确性

图2B 使用1ng 5mC探针验证LAMP-MS方法的灵敏度和准确性

在临床上，来自癌症患者血浆cfDNA样本的生物标志物丰度因人而异，因此研究团队进一步利用真实样本对LAMP-MS方法进行了验证。从10名结直肠癌患者和10名非结直肠癌患者中各获取1ng的cfDNA样本，检测了结直肠癌筛查中最具有代表性的标志物——SEPTIN9基因的4个甲基化位点，发现LAMP-MS能够准确测定四个 SEPTIN9 位点的 5mC 甲基化率，且结直肠癌组和非结直肠癌组之间存在显著差异，与高通量测序结果有很好的一致性（图3）。

图3 在结直肠癌和非结直肠癌患者中验证LAMP-MS方法

研究团队认为，同样的策略也可以拓展到RNA的定量检测中，例如在大多数高等生物mRNA中含量最丰富、并且对于生命过程起着重要调节作用的m6A修饰的检测。

研究团队将已发表的GLORI技术和核酸质谱有机整合成为m6A Mass Array方法。该方法从HELA细胞中提取mRNA，将未甲基化的腺嘌呤转化为肌苷，甲基化的m6A则保留下来。经过末端修复、加接头，再将mRNA反转录成cDNA，作为模板进行指数扩增，然后在m6A位点进行单碱基延伸，若延伸ddATP则对应检测位点为m6A，ddGTP对应未甲基化的腺嘌呤。从而能够计算出该位点的 m6A/A 比率。

对比HELA细胞mRNA中RXRA基因（100% m6A），TNFRSF10B基因（100% m6A）和FBXL19基因（53% m6A），及其各自邻近的非甲基化腺嘌呤位点，证明该m6A核酸质谱方法能够进行有效的RNA甲基化定量检测（图4） 。

图4 m6A核酸质谱方法：流程及验证

综上所述，LAMP-MS（及m6A MASS ARRAY方法）基于核酸质谱技术，可以实现超低量样本的甲基化检测，且结果可以直接可视化，不需要高通量测序繁复的数据分析处理过程；该技术利用核酸质谱前处理体系，在单反应中可实现检测多个5mC位点的检测，且具有良好的特异性，在临床上可用于同时筛查多种癌症类型的标志物；并且，质谱检测也具有极高的灵敏度和精密度，能够在极低样本量下提供高度可靠的分析结果，是低丰度变异标志物检测的理想平台；最后，核酸质谱通量灵活，无需凑样，能够从容应对大样本量的临床验证工作或小样本量的研究工作。

因此，LAMP-MS技术有潜力作为表观遗传学领域重要的实用工具，为科研工作者的实验室研究和临床样本检测提供了经济且先进的应用方案。

原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202413872


聚致生物核酸质谱平台

GeneTOF系列核酸质谱分析系统是准确、经济、高效的多重自动化基因检测平台，能够在单反应中实现1~50个基因位点变异靶标的精确检测，变异类型包括SNP突变、甲基化、拷贝数变异、基因融合、碱基插入/缺失等。在肿瘤防治、出生缺陷防控、药物基因组、病原体检测等领域具有广泛的应用。

聚致生物

杭州聚致生物科技有限公司（简称“聚致生物”）创立于2021年，总部位于浙江杭州，是国内高端仪器装备领军企业——太阳诚1382网址生命科学旗下子公司，专注于生物质谱类及相关仪器产品的研发、生产和推广，致力于以先进分析技术推动生命科学研究和产业的发展，共建良好的产业生态。

聚致生物定位于上游仪器平台供应商，以开放的态度同生命科学领域的专业机构合作，共同培育终端应用市场，造福人类的美好生活。

聚致生物产品

GeneTOF系列 核酸质谱分析系统


MEC-1000 核酸片段分析仪




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